1894年，伦琴出任符兹堡大学校长，并开始研究阴极射线。在此过程中，他发现了X射线。早在1861年，英国科学家威廉·克鲁克斯就发现通电的阴极射线管有放电产生的光线，于是就把它拍下来。可是显影后发现整张干版上什么也没照上，一片模糊。他又重复几次，依然如故，最终与一个伟大的发现失之交臂。1895年，伦琴也发现这个现象，在连续7天的试验后，他用黑纸把阴极射线管严密地包起来，屋子里漆黑一片，他发现电流通过时，两米外的荧光板上发着光。在断电之后，荧光随即消失。伦琴预感到这是一种看不见的射线，它能穿过纸和铝等密度小的物质，但不能穿过像铅那样密度大的物质。而当他把手伸到电极管和荧光板之间时，竟然在荧光板上看到了骨骼的影像。伦琴把这种新发现的射线叫作X射线，在12月28日向德国维尔茨堡物理学医学学会递交了他的《论一种新的射线——X射线的初步报告》一文，并出示了X射线的相片。伦琴的这一发现立即轰动了整个世界。德皇威廉二世随即接见了伦琴，并授予他二等普鲁士王冠勋章。
利用x射线，人们可以发现肌体内部隐藏的病患，及时得到医护。此图反映的是伦琴正利用x射线为儿童检查身体。